6 Novembre 2024
Approfondimenti

SARS-CoV-2: Chiedete per quali virus vi fanno i test! L’ennesima sciocchezza sul web

Articolo di Graziella Morace*

Su Facebook di recente è circolato  un post in cui viene messa in dubbio la validità dei test per la determinazione dell’infezione da SARS-CoV-2, il virus della Covid-19, ossia il “tampone” (il test molecolare, che rileva la presenza dell’RNA del virus nel campione prelevato tramite tampone orofaringeo) e il test sierologico (che rileva la presenza di anticorpi contro il virus nel sangue), insinuando che siano addirittura usati di proposito dei test “fasulli” per falsare i numeri dei contagiati.

La prova sarebbe che quando in televisione si parla dell’argomento non si dice “positivo a Covid-19”, preferendo un generico “positivo a coronavirus”. Secondo il post “nel corpo umano ci sono 7 coronavirus” e la RT-PCR non sarebbe specifica, ma rileverebbe la presenza di uno qualsiasi di questi. In più, nel post si afferma anche che il test di PCR sarebbe falsato dalla presenza “sconcertante” di parti del genoma umano oltre a quelle dei virus.

Anche il test sierologico non sarebbe specifico e rileverebbe la presenza di anticorpi contro gli altri coronavirus. Queste informazioni deriverebbero da un non meglio noto “amico di mestiere”.

Ma noi che non ci fidiamo del sentito dire e delle affermazioni sui social, andiamo a vedere quali sono i fatti dimostrabili.

Cerchiamo le prove.

Attualmente disponiamo di due tipi principali di saggi di laboratorio per certificare la positività all’infezione da SARS-CoV-2: i test molecolari e i test sierologici. Dopo l’infezione, a partire da una settimana dallo sviluppo dei sintomi, inizia ad essere possibile rilevare la presenza dell’RNA virale attraverso la RT-PCR dai tamponi nasofaringei e dalla saliva, anche se la probabilità è maggiore dopo la comparsa del primo sintomo. Al termine della prima settimana con sintomi cominciano ad essere rilevabili,  grazie ai test sierologici, sia gli anticorpi IgG sia quelli IgM, che raggiungono un picco entro la terza settimana per poi diminuire (fino a scomparire le IgM, molto meno le IgG).

Come funzionano questi test?

Nel caso del test molecolare RT-PCR, il materiale prelevato dal paziente tramite il tampone viene analizzato per la ricerca del genoma virale. Semplificando molto, la reazione consiste inizialmente nella sintesi di un frammento di DNA complementare all’RNA virale estratto dal campione. In seguito, tale porzione di DNA viene riprodotta più e più volte per mezzo di un enzima chiamato DNA polimerasi. La ripetizione del ciclo per molte volte consente di ottenere rapidamente milioni di molecole identiche di DNA a partire da quantità di acido nucleico estremamente ridotte. Questo processo prende il nome di amplificazione del DNA.

Un prerequisito indispensabile per la reazione di PCR è la conoscenza delle sequenze alle estremità del frammento di DNA che si desidera amplificare, in modo da costruire in laboratorio 2 primer (o inneschi) di 16-20 basi complementari alle due estremità del frammento, da cui partirà l’amplificazione. Queste brevissime sequenze vengono scelte con estrema cura, in modo che siano tipiche solo dell’organismo che si vuole cercare e cioè – nel nostro caso – che non siano presenti anche nell’uomo o nel genoma di altri coronavirus o di altri microrganismi.

I test sierologici, invece, misurano la presenza nel sangue degli anticorpi contro il virus e si basano tutti sullo stesso principio: un pezzetto del virus, fissato su una superficie solida, viene riconosciuto dagli anticorpi presenti nel sangue. Attraverso un sistema di rilevazione è poi possibile identificare gli anticorpi IgM e IgG che si sono legati.

L’affidabilità di ogni test diagnostico, sia molecolare sia sierologico, si misura attraverso due parametri fondamentali: la sensibilità e la specificità.

La sensibilità corrisponde alla proporzione di positivi identificati correttamente in quanto tali: più è alta è la sensibilità di un test, più è bassa la probabilità di imbattersi in falsi negativi (ossia in persone che secondo il test non sono infette, ma che in realtà lo sono).

La specificità invece corrisponde alla proporzione di negativi che sono correttamente identificati come negativi al virus: più è alta la specificità di un test, più è bassa la probabilità di avere dei falsi positivi (ossia, di trovare persone che secondo il test sono contagiate, quando in realtà non lo sono).

Quali sono i punti fondamentali da considerare nello sviluppo di un kit di RT-PCR affidabile per il virus SARS-CoV-2?

Per prima cosa, una volta scelte delle sequenze genomiche da usare come primers, vengono condotti studi al computer per escludere la possibilità che possano interagire con qualche porzione del genoma di altri virus o di altri microrganismi che potrebbero essere presenti nei campioni da esaminare. Una volta trovati dei primer promettenti, per dimostrare che il test è davvero specifico per il SARS-CoV-2 vengono effettuate prove in laboratorio che vengono ripetute più volte, testando i primer sia sul genoma del SARS-CoV-2 sia su quelli degli altri virus, correlati e non correlati, e di altri eventuali microrganismi, seminati in diversi tipi di campioni umani (muco, saliva, espettorato, tamponi, liquidi, ecc.). Se i primers superano questi esami, allora possono essere inseriti in un kit diagnostico.

Secondo le evidenze scientifiche più recenti, la metodica molecolare RT-PCR sui tamponi è, al momento, il test considerato più affidabile, con una sensibilità che si aggira intorno al 98% (cioè, su 100 infetti un tampone molecolare ne individua correttamente in media 98) e una specificità del 100%, perché i primer sono specifici per la sequenza genomica di SARS-CoV-2.

Alcuni test sono un po’ più sensibili, altri un po’ meno, ma nessuno rileva altri coronavirus, o rinovirus o adenovirus, virus parainfluenzali, virus influenzali, virus respiratori sinciziali o altri microrganismi che si possono trovare nello stesso campione (si vedano le note di chiusura da 1 a 6).

Allora, perché a volte ci sono falsi positivi?

Occasionalmente possono manifestarsi risultati falsi positivi poiché la RT-PCR è una metodica molto sensibile alla contaminazione, che può avvenire durante il prelievo, la conservazione/trasporto del materiale oppure durante l’esecuzione del test. Per questo, sia il prelievo che il test devono essere eseguiti da personale esperto e in laboratori qualificati.

Per quanto riguarda i test sierologici la situazione è diversa. I tipi di saggio che possono essere usati sono differenti (ELISA, CLIA, LFIA) e non tutti hanno la stessa sensibilità e specificità (7).

Questa cosa può costituire un problema, perché quando la diffusione di SARS-CoV-2 nella popolazione è bassa i test sierologici devono avere una specificità molto elevata per evitare risultati falsi positivi.

Mentre i laboratori abilitati all’esecuzione dei test sierologici utilizzano metodi più affidabili (note da 8 a 10), in genere i test rapidi (point-of-care) per la rilevazione di anticorpi sono di qualità variabile e anche i migliori sono affetti da errori, rivelandosi spesso troppo imprecisi. Alcuni test possono mostrare reattività crociata con altri coronavirus, come quelli che causano il comune raffreddore (cioè HCoV-229E, -NL63, -OC43 e -HKU1), e ciò potrebbe causare risultati falsi positivi in individui che non sono mai stati esposti a SARS-CoV-2.

La reattività crociata con SARS-CoV-2 nei test sierologici si verifica quando gli epitopi antigenici specifici dei diversi virus sono molto simili e riconosciuti dalle stesse cellule B (le cellule del sistema immunitario che producono gli anticorpi). In particolare, i test basati su proteine ​​del virus intero o sulla proteina N hanno mostrato una reattività crociata più elevata rispetto ai test basati sulla Spike o sul suo dominio S1, con conseguente minore specificità.

In ogni caso, il test sierologico da solo non deve essere utilizzato per stabilire la presenza o l’assenza di infezione o reinfezione da SARS-CoV-2, ma solo come primo screening che deve essere seguito, nel caso, dal test molecolare. In caso di negatività gli anticorpi potrebbero non essere presenti perché ricercati all’inizio della malattia, quando non sono ancora comparsi.

Nel caso di positività non vi è garanzia, allo stato attuale delle conoscenze, di immunità certa e duratura, anche perché la correlazione con l’attività protettiva dipende dalla molecola contro cui vengono misurati gli anticorpi. Se per esempio nel test si usa una proteina interna, come la N, gli anticorpi misurati non sono protettivi, mentre se si misurano gli anticorpi contro la proteina di superficie (Spike) il risultato ci dà un’indicazione del loro potere protettivo.

In conclusione, i test sierologici, specialmente quelli rapidi, non possono essere considerati particolarmente affidabili come test diagnostici, mentre la loro utilità è innegabile a livello di screening di popolazione, per studi epidemiologici su grandi numeri, in specie in un periodo di bassa incidenza, per tracciare la diffusione del virus in un determinato contesto.

Note

  1. Institut Pasteur, Paris: Real-time RT-PCR assays for the detection of SARS-CoV-2 (disponibile qui) (Specificity: Cross-reactivity with other respiratory viruses was tested with specimens known to be positive for a panel of respiratory viruses (influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), B-Victoria, B-Yamagata; influenza C; RSV A, B; hBoV; hPIV; hMPV; HRV/enterovirus; adenovirus; hCoV (HKU1, OC43, 229E and NL63); MERS-CoV. None of the tested viruses showed reactivity with PCR2 and PCR4).
  2. Ditta Fast Track Diagnostics: test FTD™ SARS-CoV-2. (disponibile qui) (A total of 32 bacterial/viral RNA/DNA cultures or samples have been tested in vitro for cross-reactivity: Human coronavirus OC43 , Human coronavirus NL63, SARS-coronavirus, MERS-coronavirus, Human coronavirus 229E , Human coronavirus HKU1 U. Influenza, parainfluenza…: No cross-reactivity)
  3. Ospedale Universitario della Charité, Berlino: test RT-PCR SARS-CoV-2 (disponibile qui) (Human coronaviruses (HCoV)-229E, -NL63, -OC43, and -HKU1 as well as MERS-CoV: No reactivity)
  4. Ditta Co-Diagnostics: Logix Smart Coronavirus disease 2019 (COVID-19) (Marchio CE, disponibile in Europa)  (disponibile qui) (Does not cross-react with the following microorganism: SARS-CoV, MERS-CoV, Human coronaviruses (HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1), Adenovirus, Influenza A H3N2, Novel Influenza A H1N1, Influenza B, Influenza C, Parainfluenza…)
  5. Becton Dickinson: SARS-CoV-2 reagent kit for BD Max system (disponibile qui) (No significant combined homologies with human genome, other coronaviruses, or human microflora that would predict potential false positive rRT-PCR results)
  6. Roche: Cobas 6800 SARS CoV2 RT-PCR (disponibile qui) (No cross-reactivity with Human coronavirus 229E 1, Human coronavirus OC43, Human coronavirus HKU1, Human coronavirus NL63, MERS coronavirus, SARS coronavirus, Adenovirus B (Type 34), Parainfluenza virus, Influenza A (H1N1), Influenza B…)
  7. Lisboa Bastos M, Tavaziva G, Abidi SK, et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 2020;370:m2516. Published 2020 Jul 1. doi:10.1136/bmj.m2516
  8. Validation of a commercially available SARS-CoV-2 serological immunoassay.  (disponibile qui) (Euroimmun ELISA PerkinElmer. Sepecificity of 100%).
  9. Wantai: SARS-CoV-2 Ab ELISA (disponibile qui)  (Specificity 100%).
  10. Diasorin, LIAISON® SARS-CoV-2 S1/S2 IgG.  (disponibile qui) (No potential cross-reactivity with other coronaviruses observed Samples tested: 2 Anti-Human CoV OC43; 1 Anti-Human CoV NL63, 1 Anti-Human CoV 229E, 1 Anti-Human MERS-COV).

*Virologa ed esperta di vaccini. Dopo oltre quarant’anni di lavoro come Primo Ricercatore dell’Istituto Superiore di Sanità è ora felicemente in pensione, ma continua ad occuparsi attivamente di argomenti scientifici.

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